(C/N:CE604)

---湖南中檢維康生物技術(shù)有限公司

1．概要

軟骨藻酸（Domoic acid，DA）是一種天然神經(jīng)性氨基酸，要由某些擬菱形藻屬和菱形藻屬的海洋硅藻產(chǎn)生，人們食用毒化的貝類，可引起記憶喪失、眩暈、昏迷甚至死亡等癥狀，根據(jù)這種毒素的中毒特征，被命名為記憶喪失性貝毒（Amnesic Shellfish Poisoning，ASP）。研究發(fā)現(xiàn)，貝組織中軟骨藻酸含量達(dá)到40mg／kg時(shí)可引起食用者中毒，150mg／kg 時(shí)有致死危險(xiǎn)，人類通過(guò)進(jìn)食可耐受的最大為20mg/kg。

2．原理

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)法。酶標(biāo)板微孔中預(yù)包被軟骨藻酸毒素抗原，樣品中殘留的軟骨藻酸毒素與微孔板上的抗原競(jìng)爭(zhēng)軟骨藻酸毒素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB顯色，吸光值與樣品中軟骨藻酸毒素含量成負(fù)相關(guān)。

3．試劑盒組成

1）包被有抗原的96微孔板：1塊（96孔，12條×8孔）

2）標(biāo)準(zhǔn)品工作液：0、0.3、1.0、3.0、9.0ng/mL        1瓶x1mL

3）軟骨藻酸毒素抗體：        1瓶x8mL

4）酶標(biāo)二抗：        1瓶x15mL

5)        10x濃縮洗滌液：        1瓶x50mL

6）樣本希釋夜：        2瓶×50mL

7）顯色底物液（TMB）：        1瓶×17mL

8）終止液：        1瓶×7mL

9）試劑盒說(shuō)明書(shū)

10）質(zhì)檢報(bào)告

4．需要的儀器、試劑

1）儀器

酶標(biāo)儀450nm（iELisa全自動(dòng)酶標(biāo)儀或相當(dāng)者）

離心機(jī)

微量移液器20μL～200μL，100μL～1000μL

-50mL離心管、8道微量移液器酶標(biāo)板振蕩器 

天平：感量0.01g

2）試劑

去離子水

甲醇

5．樣品處理

5.1貝類樣本

1）去除貝殼取出貝肉，將貝肉樣本均質(zhì)；

2）稱取1.0g均質(zhì)好的樣本于10mL離心管中；

3）加入4mL50％甲醇水，劇烈震蕩5min；

4）室溫4000r／min離心10分鐘；

5）取上清液20μL到980μL樣本希釋夜中，混勻；

6）取50μL混勻液用于檢測(cè)。

稀釋倍數(shù)：200

6．酶聯(lián)免疫分析程序

6.1測(cè)定之前注意事項(xiàng)

1）使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。

2）使用后迅速將試劑放入2-8℃冷藏。

3）在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。

4）所有孵育過(guò)程應(yīng)避免陽(yáng)光直射，并按要求用蓋板覆蓋住酶標(biāo)板。

6.2 溶液的配制

1）洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋10倍后使用（1份濃縮洗滌液加9去份離子水）。

2） 50％甲醇水的配制：量取50mL甲醇加入50mL 去離子水。

6.3測(cè)定程序

1）將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔袋封好置2-8℃冷藏保存。

2）分別吸取50μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加至相應(yīng)的微孔（雙孔）中，然后各加入50μL軟骨藻酸毒素抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸頭）。

3）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復(fù)操作四次，洗板時(shí)每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。

4）加入100μL酶標(biāo)二抗抗體加蓋，室溫溫育30分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的吸頭）。

5）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證除去孔中的液體，然后每孔加入250μL 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中的液體，拍干；重復(fù)操作四次，洗板時(shí)每次間隔30秒，洗完后用力在吸水紙上拍干。

6）每孔加入100μL底物，室溫避光溫育10分鐘。

7）每孔加入50μL終止液，混勻。

8）置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測(cè)定吸光度值（OD值），參比波長(zhǎng)630nm。（iELisa 全自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。

7．結(jié)果判定

1）所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品（0標(biāo)）的吸光度值（Bo）再乘以100％，即百分吸光度值。百分吸光度值

以軟骨藻酸毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件，更便于大量樣品的快速分析。

2）樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。 

3）如果測(cè)定值超出檢測(cè)范圍，樣品提取溶液按一定的比例用稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋。

8．注意事項(xiàng)

1）室溫低于20℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低。

2）在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥過(guò)久的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在光線下。

4）混合要均勻，洗板要充分（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。

5）反應(yīng)停止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。

6）不要使用過(guò)期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的試劑盒這樣會(huì)引起靈敏度降低。 

7）試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，切勿冷凍。

9．檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、交叉反應(yīng)率

1）精密度：批內(nèi)變異系數(shù)＜10％(n=10)

批間變異系數(shù)＜25％（n＝10）

2）靈敏度：0.3ng／mL。

3）樣本檢測(cè)線：

貝類        60ng/mL

4）準(zhǔn)確度：

貝類        90%±25%

5）交叉反應(yīng)率：

軟骨藻酸        100%